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p r o d u c t i n f o r m a t i o n a n d m a n u a l h u m a n i l - 2 e l i s a v e r s i o n 2 b m s 2 2 1 e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r q u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n o f h u m a n i n t e r l e u k i n - 2 . f o r r e s e a r c h u s e o n l y . n o t f o r d i a g n o s t i c o r t h e r a p e u t i c p r o c e d u r e s . 9 6 t e s t s h u m a n i l - 2 b m s 2 2 1 b e n d e r m e d s y s t e m s g m b h c a m p u s v i e n n a b i o c e n t e r 2 a - 1 0 3 0 v i e n n a , a u s t r i a , e u r o p e
b m s 2 2 1 i l - 2 2 7 . 0 7 . 0 5 ( 0 8 ) t a b l e o f c o n t e n t s 1 . i n t e n d e d u s e 2 2 . s u m m a r y 2 3 . p r i n c i p l e s o f t h e t e s t 4 4 . r e a g e n t s p r o v i d e d 5 5 . s t o r a g e i n s t r u c t i o n s 6 6 . s p e c i m e n c o l l e c t i o n 6 7 . m a t e r i a l s r e q u i r e d b u t n o t p r o v i d e d 7 8 . p r e c a u t i o n s f o r u s e 8 9 . p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s 1 0 1 0 . t e s t p r o t o c o l 1 4 1 1 . c a l c u l a t i o n o f r e s u l t s 2 0 1 2 . l i m i t a t i o n s 2 3 1 3 . p e r f o r m a n c e c h a r a c t e r i s t i c s 2 4 1 4 . b i b l i o g r a p h y 3 1 1 5 . o r d e r i n g i n f o r m a t i o n 3 2 1 6 . r e a g e n t p r e p a r a t i o n s u m m a r y 3 3 1 7 . t e s t p r o t o c o l s u m m a r y 3 4
2 b m s 2 2 1 i l - 2 1 . i n t e n d e d u s e t h e i l - 2 e l i s a i s a n e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y f o r q u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n o f h u m a n i n t e r l e u k i n - 2 i n c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s , h u m a n s e r u m , p l a s m a o r o t h e r b o d y f l u i d s . t h e i l - 2 e l i s a i s f o r r e s e a r c h u s e o n l y . n o t f o r u s e i n d i a g n o s t i c o r t h e r a p e u t i c p r o c e d u r e s . 2 . s u m m a r y i n t e r l e u k i n - 2 ( i l - 2 ) p l a y s a c e n t r a l r o l e i n t h e a c t i v a t i o n a n d p r o l i f e r a t i o n o f l y m p h o c y t e s t h a t h a v e b e e n p r i m e d b y a n t i g e n s ( 1 4 ) . i l - 2 p l a y s a p i v o t a l r o l e i n f o r t h e e x p a n s i o n o f m o s t t - c e l l s , n a t u r a l k i l l e r c e l l s a n d b - c e l l s d u r i n g c e r t a i n p h a s e s o f t h e i r r e s p o n s e . i l - 2 i s a 1 5 k d a g l y c o p r o t e i n e n c o d e d b y a s i n g l e g e n e l o c a t e d i n t h e q 2 6 - 2 8 r e g i o n o f h u m a n c h r o m o s o m e 4 ( 1 1 , 1 5 ) . t h e c d n a d e d u c e d p o l y p e p t i d e c o n s i s t s o f 1 5 3 a m i n o a c i d s ( 5 , 1 6 ) . i l - 2 g e n e e x p r e s s i o n i s r e g u l a t e d a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l b y s e v e r a l a c t i v a t i o n p a t h w a y s . a n t i g e n - s p e c i f i c p r o l i f e r a t i o n o f h e l p e r a n d c y t o t o x i c t - l y m p h o c y t e s f o l l o w i n g s t i m u l a t i o n i s c r i t i c a l l y d e p e n d e n t o n i l - 2 e x p r e s s i o n , s e c r e t i o n , a n d b i n d i n g t o r e c e p t o r s f o r i l - 2 i n d u c e d i n a n a u t o c r i n e f a s h i o n o n t h e s u r f a c e o f t - c e l l s ( 1 2 ) . a p a r t f r o m i t s m o s t i m p o r t a n t r o l e t o m e d i a t e a n t i g e n - s p e c i f i c t - l y m p h o c y t e p r o l i f e r a t i o n ( 1 8 ) , i l - 2 m o d u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f i n t e r f e r o n - g ( 1 0 ) a n d m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s ( 3 ) , s t i m u l a t e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f a c t i v a t e d b - c e l l s ( 1 7 ) , a u g m e n t s n a t u r a l k i l l e r c e l l a c t i v i t y ( 4 ) a n d i n h i b i t s g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y f o r m a t i o n ( 8 ) . a l t e r a t i o n s i n t h e a b i l i t y o f t - c e l l s t o s y n t h e s i z e i l - 2 h a v e b e e n o b s e r v e d i n p h y s i o l o g i c a n d p a t h o l o g i c s t a t e s .
3 b m s 2 2 1 i l - 2 b e c a u s e o f t h e c e n t r a l r o l e o f i l - 2 i n i m m u n e r e s p o n s e , i l - 2 t u r n e d o u t t o b e a v e r y i m p o r t a n t m o l e c u l e f o r d i a g n o s t i c a n d t h e r a p e u t i c i m p l i c a t i o n s . i l - 2 d i s p l a y s a n t i t u m o r a l e f f e c t s , t h u s b e i n g u s e d i n c a n c e r t h e r a p y ( 1 8 ) . m o n i t o r i n g o f i l - 2 l e v e l s i n s e r u m p r o v i d e s m o r e d e t a i l e d i n s i g h t s i n s e v e r a l p a t h o l o g i c a l s i t u a t i o n s s u c h a s c a n c e r ( 1 3 ) , i n f e c t i o u s d i s e a s e s ( 1 3 ) , t r a n s p l a n t r e j e c t i o n ( 1 , 6 ) , m u l t i p l e s c l e r o s i s ( 2 ) , r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( 9 ) , s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( 7 ) a n d t y p e i d i a b e t e s .
4 b m s 2 2 1 i l - 2 3 . p r i n c i p l e s o f t h e t e s t a n a n t i - i l - 2 m o n o c l o n a l c o a t i n g a n t i b o d y i s a d s o r b e d o n t o m i c r o w e l l s . i l - 2 p r e s e n t i n t h e s a m p l e o r s t a n d a r d b i n d s t o a n t i b o d i e s a d s o r b e d t o t h e m i c r o w e l l s ; a b i o t i n - c o n j u g a t e d p o l y c l o n a l a n t i - i l - 2 a n t i b o d y i s a d d e d a n d b i n d s t o i l - 2 c a p t u r e d b y t h e f i r s t a n t i b o d y . f o l l o w i n g i n c u b a t i o n u n b o u n d b i o t i n c o n j u g a t e d a n t i - i l - 2 i s r e m o v e d d u r i n g a w a s h s t e p . s t r e p t a v i d i n - h r p i s a d d e d a n d b i n d s t o t h e b i o t i n c o n j u g a t e d a n t i - i l - 2 . f o l l o w i n g i n c u b a t i o n u n b o u n d s t r e p t a v i d i n - h r p i s r e m o v e d d u r i n g a w a s h s t e p , a n d s u b s t r a t e s o l u t i o n r e a c t i v e w i t h h r p i s a d d e d t o t h e w e l l s . a c o l o u r e d p r o d u c t i s f o r m e d i n p r o p o r t i o n t o t h e a m o u n t o f i l - 2 p r e s e n t i n t h e s a m p l e . t h e r e a c t i o n i s t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f a c i d a n d a b s o r b a n c e i s m e a s u r e d a t 4 5 0 n m . a s t a n d a r d c u r v e i s p r e p a r e d f r o m s e v e n i l - 2 s t a n d a r d d i l u t i o n s a n d i l - 2 s a m p l e c o n c e n t r a t i o n d e t e r - m i n e d . c o a t e d m i c r o w e l l - m o n o c l o n a l c o a t i n g a n t i b o d y - i l - 2 - b i o t i n - c o n j u g a t e f i r s t i n c u b a t i o n - s t r e p t a v i d i n - c o n j u g a t e s e c o n d i n c u b a t i o n - s u b s t r a t e t h i r d i n c u b a t i o n - r e a c t e d s u b s t r a t e
5 b m s 2 2 1 i l - 2 4 . r e a g e n t s p r o v i d e d 1 a l u m i n i u m p o u c h w i t h a m i c r o w e l l p l a t e c o a t e d w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( m u r i n e ) t o h u m a n i l - 2 1 v i a l ( 1 0 0 l ) b i o t i n - c o n j u g a t e a n t i - i l - 2 p o l y c l o n a l ( r a b b i t ) a n t i b o d y 1 v i a l ( 1 5 0 l ) s t r e p t a v i d i n - h r p 2 v i a l s i l - 2 s t a n d a r d , l y o p h i l i z e d , 2 4 0 0 p g / m l u p o n r e c o n s t i t u t i o n ( a d j u s t e d t o 1 s t i n t e r n a t i o n a l s t a n d a r d f o r i n t e r l e u k i n - 2 ( h u m a n ) ( e s t a b l i s h e d 1 9 8 7 ) n o . 8 6 / 5 0 4 , 1 0 0 i u o 7 . 6 n g i l - 2 ) . 1 v i a l c o n t r o l l o w 1 v i a l c o n t r o l h i g h 1 b o t t l e ( 5 0 m l ) w a s h b u f f e r c o n c e n t r a t e 2 0 x ( p b s w i t h 1 % t w e e n 2 0 ) 1 b o t t l e ( 5 0 m l ) s a m p l e d i l u e n t 1 v i a l ( 7 m l ) s u b s t r a t e s o l u t i o n i ( t e t r a m e t h y l - b e n z i d i n e ) 1 v i a l ( 7 m l ) s u b s t r a t e s o l u t i o n i i ( 0 . 0 2 % b u f f e r e d h y d r o g e n p e r o x i d e ) 1 v i a l ( 1 2 m l ) s t o p s o l u t i o n ( 1 m p h o s p h o r i c a c i d ) 1 v i a l ( 0 . 4 m l e a c h ) b l u e - d y e , g r e e n - d y e , r e d - d y e 4 a d h e s i v e p l a t e c o v e r s r e a g e n t l a b e l s
6 b m s 2 2 1 i l - 2 5 . s t o r a g e i n s t r u c t i o n s s t o r e k i t r e a g e n t s b e t w e e n 2 a n d 8 c . i m m e d i a t e l y a f t e r u s e r e m a i n i n g r e a g e n t s s h o u l d b e r e t u r n e d t o c o l d s t o r a g e ( 2 t o 8 c ) . e x p i r y o f t h e k i t a n d r e a g e n t s i s s t a t e d o n l a b e l s . t h e e x p i r y o f t h e k i t c o m p o n e n t s c a n o n l y b e g u a r a n t e e d i f t h e c o m p o n e n t s a r e s t o r e d p r o p e r l y , a n d i f , i n c a s e o f r e p e a t e d u s e o f o n e c o m p o n e n t , t h e r e a g e n t i s n o t c o n t a m i n a t e d b y t h e f i r s t h a n d l i n g . 6 . s p e c i m e n c o l l e c t i o n c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s , h u m a n s e r u m , e d t a , h e p a r i n a n d c i t r a t e p l a s m a o r o t h e r b i o l o g i c a l s a m p l e s w i l l b e s u i t a b l e f o r u s e i n t h e a s s a y . r e m o v e s e r u m f r o m t h e c l o t o r r e d c e l l s , r e s p e c t i v e l y , a s s o o n a s p o s s i b l e a f t e r c l o t t i n g a n d s e p a r a t i o n . s a m p l e s c o n t a i n i n g a v i s i b l e p r e c i p i t a t e m u s t b e c l a r i f i e d p r i o r t o u s e i n t h e a s s a y . d o n o t u s e g r o s s l y h e m o l y z e d o r l i p e m i c s p e c i m e n s . c l i n i c a l s a m p l e s s h o u l d b e k e p t a t 2 t o 8 c a n d s e p a r a t e d r a p i d l y b e f o r e s t o r i n g a t - 2 0 c t o a v o i d l o s s o f b i o a c t i v e i l - 2 . i f s a m p l e s a r e t o b e r u n w i t h i n 2 4 h o u r s , t h e y m a y b e s t o r e d a t 2 t o 8 c . a v o i d r e p e a t e d f r e e z e - t h a w c y c l e s . f o r s t a b i l i t y a n d s u i t a b i l i t y o f s a m p l e s r e f e r t o 1 3 . e , a n d f .
7 b m s 2 2 1 i l - 2 7 . m a t e r i a l s r e q u i r e d b u t n o t p r o v i d e d - 5 m l a n d 1 0 m l g r a d u a t e d p i p e t t e s - 1 0 l t o 1 , 0 0 0 l a d j u s t a b l e s i n g l e c h a n n e l m i c r o p i p e t t e s w i t h d i s p o s a b l e t i p s - 5 0 l t o 3 0 0 l a d j u s t a b l e m u l t i c h a n n e l m i c r o p i p e t t e w i t h d i s p o s a b l e t i p s - m u l t i c h a n n e l m i c r o p i p e t t e r e s e r v o i r - b e a k e r s , f l a s k s , c y l i n d e r s n e c e s s a r y f o r p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s - d e v i c e f o r d e l i v e r y o f w a s h s o l u t i o n ( m u l t i c h a n n e l w a s h b o t t l e o r a u t o m a t i c w a s h s y s t e m ) - m i c r o w e l l s t r i p r e a d e r c a p a b l e o f r e a d i n g a t 4 5 0 n m ( 6 2 0 n m a s o p t i o n a l r e f e r e n c e w a v e l e n g t h ) - g l a s s - d i s t i l l e d o r d e i o n i z e d w a t e r - s t a t i s t i c a l c a l c u l a t o r w i t h p r o g r a m t o p e r f o r m l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s .
8 b m s 2 2 1 i l - 2 8 . p r e c a u t i o n s f o r u s e - a l l c h e m i c a l s s h o u l d b e c o n s i d e r e d a s p o t e n t i a l l y h a z a r d o u s . w e t h e r e f o r e r e c o m m e n d t h a t t h i s p r o d u c t i s h a n d l e d o n l y b y t h o s e p e r s o n s w h o h a v e b e e n t r a i n e d i n l a b o r a t o r y t e c h n i q u e s a n d t h a t i t i s u s e d i n a c c o r d a n c e w i t h t h e p r i n c i p l e s o f g o o d l a b o r a t o r y p r a c t i c e . w e a r s u i t a b l e p r o t e c t i v e c l o t h i n g s u c h a s l a b o r a t o r y o v e r a l l s , s a f e t y g l a s s e s a n d g l o v e s . c a r e s h o u l d b e t a k e n t o a v o i d c o n t a c t w i t h s k i n o r e y e s . i n t h e c a s e o f c o n t a c t w i t h s k i n o r e y e s w a s h i m m e d i a t e l y w i t h w a t e r . s e e m a t e r i a l s a f e t y d a t a s h e e t ( s ) a n d / o r s a f e t y s t a t e m e n t s ( s ) f o r s p e c i f i c a d v i c e . - r e a g e n t s a r e i n t e n d e d f o r r e s e a r c h u s e o n l y a n d a r e n o t f o r u s e i n d i a g n o s t i c o r t h e r a p e u t i c p r o c e d u r e s . - d o n o t m i x o r s u b s t i t u t e r e a g e n t s w i t h t h o s e f r o m o t h e r l o t s o r o t h e r s o u r c e s . - d o n o t u s e k i t r e a g e n t s b e y o n d e x p i r a t i o n d a t e o n l a b e l . - d o n o t e x p o s e k i t r e a g e n t s t o s t r o n g l i g h t d u r i n g s t o r a g e o r i n c u b a t i o n . - d o n o t p i p e t t e b y m o u t h . - d o n o t e a t o r s m o k e i n a r e a s w h e r e k i t r e a g e n t s o r s a m p l e s a r e h a n d l e d . - a v o i d c o n t a c t o f s k i n o r m u c o u s m e m b r a n e s w i t h k i t r e a g e n t s o r s p e c i m e n s . - r u b b e r o r d i s p o s a b l e l a t e x g l o v e s s h o u l d b e w o r n w h i l e h a n d l i n g k i t r e a g e n t s o r s p e c i m e n s . - r e a g e n t s c o n t a i n i n g t h i m e r o s a l a s p r e s e r v a t i v e m a y b e t o x i c i f i n g e s t e d . - a v o i d c o n t a c t o f s u b s t r a t e s o l u t i o n s w i t h o x i d i z i n g a g e n t s a n d m e t a l .
9 b m s 2 2 1 i l - 2 - a v o i d s p l a s h i n g o r g e n e r a t i o n o f a e r o s o l s . - i n o r d e r t o a v o i d m i c r o b i a l c o n t a m i n a t i o n o r c r o s s - c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s o r s p e c i m e n s w h i c h m a y i n v a l i d a t e t h e t e s t u s e d i s p o s a b l e p i p e t t e t i p s a n d / o r p i p e t t e s . - u s e c l e a n , d e d i c a t e d r e a g e n t t r a y s f o r d i s p e n s i n g t h e c o n j u g a t e a n d s u b s t r a t e r e a g e n t s . - e x p o s u r e t o a c i d s w i l l i n a c t i v a t e t h e c o n j u g a t e . - g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r o r d e i o n i z e d w a t e r m u s t b e u s e d f o r r e a g e n t p r e p a r a t i o n . - s u b s t r a t e s o l u t i o n s m u s t b e a t r o o m t e m p e r a t u r e p r i o r t o u s e . - d e c o n t a m i n a t e a n d d i s p o s e s p e c i m e n s a n d a l l p o t e n t i a l l y c o n t a m i n a t e d m a t e r i a l s a s i f t h e y c o u l d c o n t a i n i n f e c t i o u s a g e n t s . t h e p r e f e r r e d m e t h o d o f d e c o n t a m i n a t i o n i s a u t o c l a v i n g f o r a m i n i m u m o f 1 h o u r a t 1 2 1 . 5 c . - l i q u i d w a s t e s n o t c o n t a i n i n g a c i d a n d n e u t r a l i z e d w a s t e m a y b e m i x e d w i t h s o d i u m h y p o c h l o r i t e i n v o l u m e s s u c h t h a t t h e f i n a l m i x t u r e c o n t a i n s 1 . 0 % s o d i u m h y p o c h l o r i t e . a l l o w 3 0 m i n u t e s f o r e f f e c t i v e d e c o n t a m i n a t i o n . l i q u i d w a s t e c o n t a i n i n g a c i d m u s t b e n e u t r a l i z e d p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f s o d i u m h y p o c h l o r i t e .
1 0 b m s 2 2 1 i l - 2 9 . p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s a . w a s h b u f f e r i f c r y s t a l s h a v e f o r m e d i n t h e w a s h b u f f e r c o n c e n t r a t e , w a r m i t g e n t l y u n t i l t h e y h a v e c o m p l e t e l y d i s s o l v e d . p o u r e n t i r e c o n t e n t s ( 5 0 m l ) o f t h e w a s h b u f f e r c o n c e n t r a t e i n t o a c l e a n 1 , 0 0 0 m l g r a d u a t e d c y l i n d e r . b r i n g f i n a l v o l u m e t o 1 , 0 0 0 m l w i t h g l a s s - d i s t i l l e d o r d e i o n i z e d w a t e r . m i x g e n t l y t o a v o i d f o a m i n g . t h e p h o f t h e f i n a l s o l u t i o n s h o u l d a d j u s t t o 7 . 4 . t r a n s f e r t o a c l e a n w a s h b o t t l e a n d s t o r e a t 2 t o 2 5 c . p l e a s e n o t e t h a t t h e w a s h b u f f e r i s s t a b l e f o r 3 0 d a y s . w a s h b u f f e r m a y b e p r e p a r e d a s n e e d e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g t a b l e : n u m b e r w a s h b u f f e r d i s t i l l e d o f s t r i p s c o n c e n t r a t e ( m l ) w a t e r ( m l ) 1 - 6 2 5 4 7 5 1 - 1 2 5 0 9 5 0 b . p r e p a r a t i o n o f b i o t i n - c o n j u g a t e m a k e a 1 : 1 0 0 d i l u t i o n w i t h s a m p l e d i l u e n t i n a c l e a n p l a s t i c t u b e a s n e e d e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g t a b l e : n u m b e r b i o t i n - c o n j u g a t e s a m p l e d i l u e n t o f s t r i p s ( m l ) ( m l ) 1 - 6 0 . 0 3 2 . 9 7 1 - 1 2 0 . 0 6 5 . 9 4
1 1 b m s 2 2 1 i l - 2 c . p r e p a r a t i o n o f i l - 2 s t a n d a r d r e c o n s t i t u t e i l - 2 s t a n d a r d b y a d d i t i o n o f d i s t i l l e d w a t e r . r e c o n s t i t u t i o n v o l u m e i s s t a t e d o n t h e l a b e l o f t h e s t a n d a r d v i a l . m a k e s u r e t h e c o n t e n t s e n t i r e l y d i s s o l v e b y g e n t l e s w i r l i n g . t h e s t a n d a r d s o l u t i o n o b t a i n e d i s 2 4 0 0 p g / m l . d . p r e p a r a t i o n o f s t r e p t a v i d i n - h r p m a k e a 1 : 1 0 0 d i l u t i o n o f t h e c o n c e n t r a t e d s t r e p t a v i d i n - h r p s o l u t i o n i n s a m p l e d i l u e n t a s n e e d e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g t a b l e : n u m b e r o f s t r i p s s t r e p t a v i d i n - h r p ( m l ) s a m p l e d i l u e n t ( m l ) 1 - 6 0 . 0 6 6 1 - 1 2 0 . 1 2 1 2 e . p r e p a r a t i o n o f c o n t r o l s s o l u b i l i z e b y a d d i n g 8 0 0 l s a m p l e d i l u e n t t o e a c h v i a l l a b e l e d h u m a n i l - 2 c o n t r o l . s w i r l o r m i x g e n t l y t o e n s u r e c o m p l e t e a n d h o m o g e n e o u s s o l u b i l i z a t i o n . a d d d i r e c t l y t o t h e p l a t e , n o f u r t h e r d i l u t i o n n e c e s s a r y . f o r c o n t r o l r a n g e p l e a s e r e f e r t o c e r t i f i c a t e o f a n a l y s i s o r v i a l l a b e l . s t o r e r e c o n s t i t u t e d c o n t r o l s a l i q u o t e d a t C 2 0 c . a v o i d r e p e a t e d f r e e z e a n d t h a w c y c l e s . f . t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n u s i n g c l e a n p i p e t t e s a n d c o n t a i n e r s k n o w n t o b e m e t a l f r e e , d i s p e n s e a n e q u a l v o l u m e o f s u b s t r a t e s o l u t i o n i i n t o s u b s t r a t e s o l u t i o n i i a n d s w i r l g e n t l y t o m i x . t h e t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n m a y d e v e l o p a y e l l o w t i n g e o v e r t i m e . t h i s d o e s n o t s e e m t o a f f e c t p r o d u c t p e r f o r m a n c e . a b l u e c o l o u r p r e s e n t i n t h e t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n , h o w e v e r , i n d i c a t e s t h a t i t h a s b e e n c o n t a m i n a t e d a n d m u s t b e d i s c a r d e d . t h e t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n m u s t b e u s e d w i t h i n a f e w m i n u t e s a f t e r m i x i n g . w a r m t o r o o m t e m p e r a t u r e b e f o r e u s e . a v o i d d i r e c t e x p o s u r e o f t m b r e a g e n t s t o i n t e n s e l i g h t a n d o x i d i z i n g a g e n t s d u r i n g s t o r a g e o r i n c u b a t i o n .
1 2 b m s 2 2 1 i l - 2 s u b s t r a t e p r e p a r a t i o n a c c o r d i n g t o a s s a y s i z e : n u m b e r s u b s t r a t e s u b s t r a t e o f s t r i p s s o l u t i o n i ( m l ) s o l u t i o n i i ( m l ) 1 - 6 3 . 0 3 . 0 1 - 1 2 6 . 0 6 . 0 g . a d d i t i o n o f c o l o u r - g i v i n g d y e s i n o r d e r t o h e l p o u r c u s t o m e r s t o a v o i d a n y m i s t a k e s i n p i p e t t i n g t h e b e n d e r m e d s y s t e m s e l i s a s , b e n d e r m e d s y s t e m s n o w o f f e r s a n e w t o o l t h a t h e l p s t o m o n i t o r t h e a d d i t i o n o f e v e n v e r y s m a l l v o l u m e s o f a s o l u t i o n t o t h e r e a c t i o n w e l l b y g i v i n g d i s t i n c t i v e c o l o u r s t o e a c h s t e p o f t h e e l i s a p r o c e d u r e . t h i s p r o c e d u r e i s o p t i o n a l , d o e s n o t i n a n y w a y i n t e r f e r e w i t h t h e t e s t r e s u l t s , a n d i s d e s i g n e d t o h e l p t h e c u s t o m e r w i t h t h e p e r f o r m a n c e o f t h e t e s t , b u t c a n a l s o b e o m i t t e d , j u s t f o l l o w i n g t h e i n s t r u c t i o n b o o k l e t . a l t e r n a t i v e l y , t h e d y e s o l u t i o n s f r o m t h e s t o c k s p r o v i d e d ( b l u e - d y e , g r e e n - d y e , r e d - d y e ) c a n b e a d d e d t o t h e r e a g e n t s a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g g u i d e l i n e s : 1 . d i l u e n t : b e f o r e s a m p l e d i l u t i o n a d d t h e b l u e - d y e a t a d i l u t i o n o f 1 : 2 5 0 ( s e e t a b l e b e l o w ) t o t h e a p p r o p r i a t e d i l u e n t ( 1 x ) a c c o r d i n g t o t h e t e s t p r o t o c o l . a f t e r a d d i t i o n o f b l u e - d y e , p r o c e e d a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n b o o k l e t . 5 m l d i l u e n t 2 0 l b l u e - d y e 1 2 m l d i l u e n t 4 8 l b l u e - d y e 5 0 m l d i l u e n t 2 0 0 l b l u e - d y e 2 . b i o t i n - c o n j u g a t e : b e f o r e d i l u t i o n o f t h e c o n c e n t r a t e d c o n j u g a t e , a d d t h e g r e e n - d y e a t a d i l u t i o n o f 1 : 1 0 0 ( s e e t a b l e b e l o w ) t o t h e d i l u e n t u s e d f o r t h e f i n a l c o n j u g a t e d i l u t i o n . p r o c e e d a f t e r a d d i t i o n o f g r e e n - d y e a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n b o o k l e t , p r e p a r a t i o n o f b i o t i n - c o n j u g a t e . g a t e i s s u p p l i e d r e a d y t o u s e , d i r e c t l y a d d t h e g r e e n - d y e a t a d i l u t i o n o f 1 : 1 0 0 .
1 3 b m s 2 2 1 i l - 2 3 m l d i l u e n t 3 0 l g r e e n - d y e 6 m l d i l u e n t 6 0 l g r e e n - d y e 1 2 m l d i l u e n t 1 2 0 l g r e e n - d y e 3 . s t r e p t a v i d i n - h r p : b e f o r e d i l u t i o n o f t h e c o n c e n t r a t e d s t r e p t a v i d i n - h r p , a d d t h e r e d - d y e a t a d i l u t i o n o f 1 : 2 5 0 ( s e e t a b l e b e l o w ) t o t h e d i l u e n t u s e d f o r t h e f i n a l s t r e p t a v i d i n - h r p d i l u t i o n . p r o c e e d a f t e r a d d i t i o n o f r e d - d y e a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n b o o k l e t , p r e p a r a t i o n o f s t r e p t a v i d i n - h r p . 6 m l d i l u e n t 2 4 l r e d - d y e 1 2 m l d i l u e n t 4 8 l r e d - d y e
1 4 b m s 2 2 1 i l - 2 1 0 . t e s t p r o t o c o l a . p r e p a r e r e a g e n t s i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e a n d m i x t h e m t h o r o u g h l y w i t h o u t f o a m i n g . b . d i l u t i o n o f s a m p l e s : s e r u m o r p l a s m a s a m p l e s a r e a p p l i e d u n d i l u t e d . 2 x 1 0 0 l s e r u m o r p l a s m a a r e n e e d e d f o r d u p l i c a t e m e a s u r e m e n t . b e c a u s e i l - 2 l e v e l s i n c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s m a y v a r y c o n s i d e r a b l y , i t i s n o t p o s s i b l e t o r e c o m m e n d a p r e d e t e r m i n e d d i l u t i o n f a c t o r . o p t i m a l d i l u t i o n h a s t o b e d e t e r m i n e d f o r e a c h i n d i v i d u a l s a m p l e . f o r u n k n o w n c e l l c u l t u r e s a m p l e s i t i s u s e f u l t o a n a l y z e u n d i l u t e d a s w e l l a s p r e d i l u t e d s a m p l e s ( e . g . 1 : 2 0 - 1 : 5 0 ) i n p a r a l l e l , t h e r e b y c o v e r i n g a w i d e r r a n g e i n o n e a s s a y . c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s w i t h v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f i l - 2 r e q u i r e h i g h d i l u t i o n s ( e . g . u p t o 1 : 2 0 0 0 ) i n o r d e r t o b e m e a s u r e d c o r r e c t l y . s u c h s a m p l e s s h o u l d b e p r e d i l u t e d i n t h e r e s p e c t i v e c u l t u r e m e d i u m . f i n a l d i l u t i o n s h o u l d b e p e r f o r m e d i n s a m p l e d i l u e n t s i m i l a r t o o n e o f t h e e x a m p l e s s h o w n b e l o w .
1 5 b m s 2 2 1 i l - 2 s o m e e x a m p l e s o f g e n e r a t i n g d i l u t i o n s o f c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s d i l u t i o n s a m p l e v o l u m e s a m p l e d i l u e n t t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f o r i g i n a l s a m p l e , r e s u l t m u s t b e m u l t i p l i e d b y : 1 : 5 5 0 l s a m p l e 2 0 0 l s a m p l e d i l u e n t x 5 1 : 1 0 2 5 l s a m p l e 2 2 5 l s a m p l e d i l u e n t x 1 0 1 : 5 0 1 0 l s a m p l e 4 9 0 l s a m p l e d i l u e n t x 5 0 1 : 1 0 0 a : 1 0 l s a m p l e b : 2 5 l p r e d i l u t i o n " a " 9 0 l s a m p l e d i l u e n t 2 2 5 l s a m p l e d i l u e n t x 1 0 0 1 : 1 0 0 0 a : 1 0 l s a m p l e b : 2 5 l p r e d i l u t i o n " a " 9 9 0 l c u l t u r e m e d i u m 2 2 5 l s a m p l e d i l u e n t x 1 0 0 0 1 : 2 0 0 0 a : 1 0 l s a m p l e b : 1 0 l p r e d i l u t i o n " a " 3 9 0 l c u l t u r e m e d i u m 4 9 0 l s a m p l e d i l u e n t x 2 0 0 0 c . d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f m i c r o w e l l s t r i p s r e q u i r e d t o t e s t t h e d e s i r e d n u m b e r o f s a m p l e s p l u s a p p r o p r i a t e n u m b e r o f w e l l s n e e d e d f o r r u n n i n g b l a n k s a n d s t a n d a r d s . e a c h s a m p l e , s t a n d a r d , b l a n k , a n d o p t i o n a l c o n t r o l s a m p l e s h o u l d b e a s s a y e d i n d u p l i c a t e . r e m o v e e x t r a m i c r o w e l l s t r i p s c o a t e d w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( m u r i n e ) t o h u m a n i l - 2 f r o m h o l d e r a n d s t o r e i n f o i l b a g w i t h t h e d e s i c c a n t p r o v i d e d a t 2 - 8 c s e a l e d t i g h t l y .
1 6 b m s 2 2 1 i l - 2 d . w a s h t h e m i c r o w e l l s t r i p s t w i c e w i t h a p p r o x i m a t e l y 3 0 0 l w a s h b u f f e r p e r w e l l w i t h t h o r o u g h a s p i r a t i o n o f m i c r o w e l l c o n t e n t s b e t w e e n w a s h e s . t a k e c a r e n o t t o s c r a t c h t h e s u r f a c e o f t h e m i c r o w e l l s . a f t e r t h e l a s t w a s h , e m p t y w e l l s a n d t a p m i c r o w e l l s t r i p s o n a b s o r b e n t p a d o r p a p e r t o w e l t o r e m o v e e x c e s s w a s h b u f f e r . u s e t h e m i c r o w e l l s t r i p s i m m e d i a t e l y a f t e r w a s h i n g o r p l a c e u p s i d e d o w n o n a w e t a b s o r b e n t p a p e r f o r n o t l o n g e r t h a n 1 5 m i n u t e s . d o n o t a l l o w w e l l s t o d r y . e . a d d 1 0 0 l o f s a m p l e d i l u e n t i n d u p l i c a t e t o a l l s t a n d a r d w e l l s . p r e p a r e s t a n d a r d d i l u t i o n s b y p i p e t t i n g 1 0 0 l o f r e c o n s t i t u t e d ( r e f e r t o p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s , 9 . c . ) i l - 2 s t a n d a r d , i n d u p l i c a t e , i n t o w e l l s a 1 a n d a 2 . m i x t h e c o n t e n t s o f w e l l s a 1 a n d a 2 b y r e p e a t e d a s p i r a t i o n a n d e j e c t i o n , a n d t r a n s f e r 1 0 0 l t o w e l l b 1 a n d b 2 , r e s p e c t i v e l y . t a k e c a r e n o t t o s c r a t c h t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e m i c r o w e l l s . c o n t i n u e t h i s p r o c e d u r e f i v e t i m e s , c r e a t i n g t w o r o w s o f i l - 2 s t a n d a r d d i l u t i o n s r a n g i n g f r o m 1 2 0 0 t o 1 9 p g / m l . d i s c a r d 1 0 0 l o f t h e c o n t e n t s f r o m t h e l a s t m i c r o w e l l s ( g 1 , g 2 ) u s e d . f i g u r e 1 . p r e p a r a t i o n o f i l - 2 s t a n d a r d d i l u t i o n s : i l - 2 s t a n d a r d 1 0 0 l t r a n s f e r 1 0 0 l 1 0 0 l s a m p l e d i l u e n t d i s c a r d 1 0 0 l a 1 b 1 c 1 d 1 - g 1
1 7 b m s 2 2 1 i l - 2 f i g u r e 2 . d i a g r a m d e p i c t i n g a n e x a m p l e o f t h e a r r a n g e m e n t o f b l a n k s , s t a n d a r d s a n d s a m p l e s i n t h e m i c r o w e l l s t r i p s : 1 2 3 4 a s t a n d a r d 1 s t a n d a r d 1 s a m p l e 1 s a m p l e 1 ( 1 2 0 0 p g / m l ) ( 1 2 0 0 p g / m l ) b s t a n d a r d 2 s t a n d a r d 2 s a m p l e 2 s a m p l e 2 ( 6 0 0 p g / m l ) ( 6 0 0 p g / m l ) c s t a n d a r d 3 s t a n d a r d 3 s a m p l e 3 s a m p l e 3 ( 3 0 0 p g / m l ) ( 3 0 0 p g / m l ) d s t a n d a r d 4 s t a n d a r d 4 s a m p l e 4 s a m p l e 4 ( 1 5 0 p g / m l ) ( 1 5 0 p g / m l ) e s t a n d a r d 5 s t a n d a r d 5 s a m p l e 5 s a m p l e 5 ( 7 5 p g / m l ) ( 7 5 p g / m l ) f s t a n d a r d 6 s t a n d a r d 6 s a m p l e 6 s a m p l e 6 ( 3 8 p g / m l ) ( 3 8 p g / m l ) g s t a n d a r d 7 s t a n d a r d 7 s a m p l e 7 s a m p l e 7 ( 1 9 p g / m l ) ( 1 9 p g / m l ) h b l a n k b l a n k s a m p l e 8 s a m p l e 8 f . a d d 1 0 0 l o f s a m p l e d i l u e n t i n d u p l i c a t e t o t h e b l a n k w e l l s . g . a d d 1 0 0 l o f e a c h s a m p l e , i n d u p l i c a t e , t o t h e d e s i g n a t e d w e l l s . h . p r e p a r e b i o t i n - c o n j u g a t e . ( r e f e r t o p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s ) i . a d d 5 0 l o f d i l u t e d b i o t i n - c o n j u g a t e t o a l l w e l l s , i n c l u d i n g t h e b l a n k w e l l s . j . c o v e r w i t h a p l a t e c o v e r a n d i n c u b a t e a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) f o r 2 h o u r s o n a m i c r o p l a t e s h a k e r s e t a t 2 0 0 r p m . k . r e m o v e p l a t e c o v e r a n d e m p t y w e l l s . w a s h m i c r o w e l l s t r i p s 4 t i m e s a c c o r d i n g t o p o i n t d . o f t h e t e s t p r o t o c o l . p r o c e e d i m m e d i a t e l y t o t h e n e x t s t e p . l . p r e p a r e s t r e p t a v i d i n - h r p . ( r e f e r t o p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s )
1 8 b m s 2 2 1 i l - 2 m . a d d 1 0 0 l o f d i l u t e d s t r e p t a v i d i n - h r p t o a l l w e l l s , i n c l u d i n g t h e b l a n k w e l l s . n . c o v e r w i t h a p l a t e c o v e r a n d i n c u b a t e a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) f o r 1 h o u r o n a m i c r o p l a t e s h a k e r a t 2 0 0 r p m . o . p r e p a r e t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n a f e w m i n u t e s p r i o r t o u s e ( r e f e r t o p r e p a r a t i o n o f r e a g e n t s ) . p . r e m o v e p l a t e c o v e r a n d e m p t y w e l l s . w a s h m i c r o w e l l s t r i p s 4 t i m e s a c c o r d i n g t o p o i n t d . o f t h e t e s t p r o t o c o l . p r o c e e d i m m e d i a t e l y t o t h e n e x t s t e p . q . p i p e t t e 1 0 0 l o f m i x e d t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n t o a l l w e l l s , i n c l u d i n g t h e b l a n k w e l l s . r . i n c u b a t e t h e m i c r o w e l l s t r i p s a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) f o r a b o u t 1 0 m i n u t e s , i f a v a i l a b l e o n a r o t a t o r s e t a t 1 0 0 r p m . a v o i d d i r e c t e x p o s u r e t o i n t e n s e l i g h t . t h e c o l o u r d e v e l o p m e n t o n t h e p l a t e s h o u l d b e m o n i t o r e d a n d t h e s u b s t r a t e r e a c t i o n s t o p p e d ( s e e p o i n t s . o f t h i s p r o t o c o l ) b e f o r e p o s i t i v e w e l l s a r e n o l o n g e r p r o p e r l y r e c o r d a b l e . i t i s r e c o m m e n d e d t o a d d t h e s t o p s o l u t i o n w h e n t h e h i g h e s t s t a n d a r d h a s d e v e l o p e d a d a r k b l u e c o l o u r . a l t e r n a t i v e l y t h e c o l o u r d e v e l o p m e n t c a n b e m o n i t o r e d b y t h e e l i s a r e a d e r a t 6 2 0 n m . t h e s u b s t r a t e r e a c t i o n s h o u l d b e s t o p p e d a s s o o n a s a n o d o f 0 . 6 C 0 . 6 5 i s r e a c h e d . s . s t o p t h e e n z y m e r e a c t i o n b y q u i c k l y p i p e t t i n g 1 0 0 l o f s t o p s o l u t i o n i n t o e a c h w e l l , i n c l u d i n g t h e b l a n k w e l l s . i t i s i m p o r t a n t t h a t t h e s t o p s o l u t i o n i s s p r e a d q u i c k l y a n d u n i f o r m l y t h r o u g h o u t t h e m i c r o w e l l s t o c o m p l e t e l y i n a c t i v a t e t h e e n z y m e . r e s u l t s m u s t b e r e a d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e s t o p s o l u t i o n i s a d d e d o r w i t h i n o n e h o u r i f t h e m i c r o w e l l s t r i p s a r e s t o r e d a t 2 - 8 c i n t h e d a r k . t . r e a d a b s o r b a n c e o f e a c h m i c r o w e l l o n a s p e c t r o - p h o t o m e t e r u s i n g 4 5 0 n m a s t h e p r i m a r y w a v e l e n g t h ( o p t i o n a l l y 6 2 0 n m a s t h e r e f e r e n c e w a v e l e n g t h ; 6 1 0 n m t o 6 5 0 n m i s a c c e p t a b l e ) . b l a n k t h e p l a t e r e a d e r a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s b y u s i n g
1 9 b m s 2 2 1 i l - 2 t h e b l a n k w e l l s . d e t e r m i n e t h e a b s o r b a n c e o f b o t h , t h e s a m p l e s a n d t h e i l - 2 s t a n d a r d s . n o t e : i n c a s e o f i n c u b a t i o n w i t h o u t s h a k i n g t h e o b t a i n e d o . d . v a l u e s m a y b e l o w e r t h a n i n d i c a t e d b e l o w . n e v e r t h e l e s s t h e r e s u l t s a r e s t i l l v a l i d .
2 0 b m s 2 2 1 i l - 2 1 1 . c a l c u l a t i o n o f r e s u l t s - c a l c u l a t e t h e a v e r a g e a b s o r b a n c e v a l u e s f o r e a c h s e t o f d u p l i c a t e s t a n d a r d s a n d s a m p l e s . d u p l i c a t e s s h o u l d b e w i t h i n 2 0 p e r c e n t o f t h e m e a n . - c r e a t e a s t a n d a r d c u r v e b y p l o t t i n g t h e m e a n a b s o r b a n c e f o r e a c h s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n o n t h e o r d i n a t e a g a i n s t t h e i l - 2 c o n c e n t r a t i o n o n t h e a b s c i s s a . d r a w a b e s t f i t c u r v e t h r o u g h t h e p o i n t s o f t h e g r a p h . - t o d e t e r m i n e t h e c o n c e n t r a t i o n o f c i r c u l a t i n g i l - 2 f o r e a c h s a m p l e , f i r s t f i n d t h e m e a n a b s o r b a n c e v a l u e o n t h e o r d i n a t e a n d e x t e n d a h o r i z o n t a l l i n e t o t h e s t a n d a r d c u r v e . a t t h e p o i n t o f i n t e r s e c t i o n , e x t e n d a v e r t i c a l l i n e t o t h e a b s c i s s a a n d r e a d t h e c o r r e s p o n d i n g i l - 2 c o n c e n t r a t i o n . i f s a m p l e s h a v e b e e n d i l u t e d a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n s g i v e n i n t h i s m a n u a l ( e . g . c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s ) , t h e c o n c e n t r a t i o n r e a d f r o m t h e s t a n d a r d c u r v e m u s t b e m u l t i p l i e d b y t h e r e s p e c t i v e d i l u t i o n f a c t o r . n o t e : c a l c u l a t i o n o f s a m p l e s w i t h a n o . d . e x c e e d i n g 2 . 0 m a y r e s u l t i n i n c o r r e c t , l o w i l - 2 l e v e l s . s u c h s a m p l e s s h o u l d b e r e - a n a l y z e d a t h i g h e r d i l u t i o n r a t e i n o r d e r t o p r e c i s e l y q u a n t i t a t e t h e a c t u a l i l - 2 l e v e l . i t i s s u g g e s t e d t h a t e a c h t e s t i n g f a c i l i t y e s t a b l i s h e s a c o n t r o l s a m p l e o f k n o w n i l - 2 c o n c e n t r a t i o n a n d r u n s t h i s a d d i t i o n a l c o n t r o l w i t h e a c h a s s a y . i f t h e v a l u e s o b t a i n e d a r e n o t w i t h i n t h e e x p e c t e d r a n g e o f t h i s c o n t r o l , t h e a s s a y r e s u l t s m a y b e i n v a l i d . - a r e p r e s e n t a t i v e s t a n d a r d c u r v e i s s h o w n i n f i g u r e 3 . t h i s c u r v e c a n n o t b e u s e d t o d e r i v e t e s t r e s u l t s . e v e r y l a b o r a t o r y m u s t p r e p a r e a s t a n d a r d c u r v e f o r e a c h g r o u p o f m i c r o w e l l s t r i p s a s s a y e d .
2 1 b m s 2 2 1 i l - 2 f i g u r e 3 . r e p r e s e n t a t i v e s t a n d a r d c u r v e f o r i l - 2 e l i s a . i l - 2 w a s d i l u t e d i n s e r i a l t w o - f o l d s t e p s i n s a m p l e d i l u e n t , s y m b o l s r e p r e s e n t t h e m e a n o f t h r e e p a r a l l e l t i t r a t i o n s . d o n o t u s e t h i s s t a n d a r d c u r v e t o d e r i v e t e s t r e s u l t s . a s t a n d a r d c u r v e m u s t b e r u n f o r e a c h g r o u p o f m i c r o w e l l s t r i p s a s s a y e d . 0 0 , 5 1 1 , 5 2 2 , 5 0 4 0 0 8 0 0 1 2 0 0 i l - 2 c o n c e n t r a t i o n [ p g / m l ] a b s o r p t i o n 4 5 0 n m
2 2 b m s 2 2 1 i l - 2 t y p i c a l d a t a u s i n g t h e i l - 2 e l i s a m e a s u r i n g w a v e l e n g t h : 4 5 0 n m r e f e r e n c e w a v e l e n g t h : 6 2 0 n m s t a n d a r d i l - 2 c o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) o . d . ( 4 5 0 n m ) o . d . m e a n c . v . ( % ) 1 1 2 0 0 2 . 2 9 4 2 . 3 7 2 3 . 3 1 2 0 0 2 . 4 5 0 2 6 0 0 1 . 1 6 6 1 . 1 6 7 0 . 2 6 0 0 1 . 1 6 8 3 3 0 0 0 . 5 9 2 0 . 5 7 7 2 . 6 3 0 0 0 . 5 6 2 4 1 5 0 0 . 3 1 3 0 . 3 1 0 1 . 0 1 5 0 0 . 3 0 7 5 7 5 0 . 1 7 1 0 . 1 7 2 0 . 4 7 5 0 . 1 7 3 6 3 8 0 . 1 0 5 0 . 1 0 2 2 . 0 3 8 0 . 1 0 0 7 1 9 0 . 0 6 6 0 . 0 6 3 4 . 8 1 9 0 . 0 6 0 b l a n k 0 0 . 0 2 9 0 . 0 2 8 0 0 . 0 2 6
2 3 b m s 2 2 1 i l - 2 1 2 . l i m i t a t i o n s - s i n c e e x a c t c o n d i t i o n s m a y v a r y f r o m a s s a y t o a s s a y , a s t a n d a r d c u r v e m u s t b e e s t a b l i s h e d f o r e v e r y r u n . - b a c t e r i a l o r f u n g a l c o n t a m i n a t i o n o f e i t h e r s a m p l e s o r r e a g e n t s o r c r o s s - c o n t a m i n a t i o n b e t w e e n r e a g e n t s m a y c a u s e e r r o n e o u s r e s u l t s . - d i s p o s a b l e p i p e t t e t i p s , f l a s k s o r g l a s s w a r e a r e p r e f e r r e d , r e u s a b l e g l a s s w a r e m u s t b e w a s h e d a n d t h o r o u g h l y r i n s e d o f a l l d e t e r g e n t s b e f o r e u s e . - i m p r o p e r o r i n s u f f i c i e n t w a s h i n g a t a n y s t a g e o f t h e p r o c e d u r e w i l l r e s u l t i n e i t h e r f a l s e p o s i t i v e o r f a l s e n e g a t i v e r e s u l t s . c o m p l e t e l y e m p t y w e l l s b e f o r e d i s p e n s i n g f r e s h w a s h b u f f e r , f i l l w i t h w a s h b u f f e r a s i n d i c a t e d f o r e a c h w a s h c y c l e a n d d o n o t a l l o w w e l l s t o s i t u n c o v e r e d o r d r y f o r e x t e n d e d p e r i o d s .
2 4 b m s 2 2 1 i l - 2 1 3 . p e r f o r m a n c e c h a r a c t e r i s t i c s a . s e n s i t i v i t y t h e l i m i t o f d e t e c t i o n o f i l - 2 d e f i n e d a s t h e a n a l y t e c o n c e n t r a t i o n r e s u l t i n g i n a n a b s o r p t i o n s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t o f t h e d i l u t i o n m e d i u m ( m e a n p l u s t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s ) w a s d e t e r m i n e d t o b e 9 . 9 p g / m l ( m e a n o f 6 i n d e p e n d e n t a s s a y s ) . b . r e p r o d u c i b i l i t y a . i n t r a - a s s a y r e p r o d u c i b i l i t y w i t h i n t h e a s s a y w a s e v a l u a t e d i n t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . e a c h a s s a y w a s c a r r i e d o u t w i t h 6 r e p l i c a t e s o f 4 s e r u m a n d 4 c e l l c u l t u r e s a m p l e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f i l - 2 . t w o s t a n d a r d c u r v e s w e r e r u n o n e a c h p l a t e . d a t a b e l o w s h o w t h e m e a n i l - 2 c o n c e n t r a t i o n a n d t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n f o r e a c h s a m p l e . t h e o v e r a l l i n t r a - a s s a y c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n h a s b e e n c a l c u l a t e d t o b e 5 . 2 % .
2 5 b m s 2 2 1 i l - 2 p o s i t i v e s a m p l e e x p e r i m e n t i l - 2 c o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n ( % ) 1 1 2 5 1 7 . 9 2 2 8 3 2 . 2 3 2 3 8 8 . 8 2 1 1 5 0 5 . 6 2 1 7 0 4 . 6 3 1 2 8 6 . 9 3 1 3 3 6 7 . 4 2 3 9 6 2 . 8 3 3 3 2 5 . 6 4 1 1 2 7 4 . 5 2 1 4 6 6 . 5 3 1 2 3 4 . 6 5 1 2 0 2 3 . 4 2 2 3 6 4 . 3 3 2 0 2 4 . 8 6 1 7 8 5 . 9 2 8 7 4 . 5 3 6 8 6 . 5 7 1 2 4 1 2 . 8 2 2 7 3 3 . 1 3 2 6 4 4 . 4 8 1 1 6 8 6 . 2 2 1 9 3 7 . 5 3 1 6 9 4 . 8
2 6 b m s 2 2 1 i l - 2 b . i n t e r - a s s a y a s s a y t o a s s a y r e p r o d u c i b i l i t y w i t h i n o n e l a b o r a t o r y w a s e v a l u a t e d i n t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s b y t h r e e t e c h n i c i a n s . e a c h a s s a y w a s c a r r i e d o u t w i t h 6 r e p l i c a t e s o f 8 c e l l c u l t u r e s a m p l e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f i l - 2 . t w o s t a n d a r d c u r v e s w e r e r u n o n e a c h p l a t e . d a t a b e l o w s h o w t h e m e a n i l - 2 c o n c e n t r a t i o n a n d t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n c a l c u l a t e d o n 1 8 d e t e r m i n a t i o n s o f e a c h s a m p l e . t h e o v e r a l l i n t e r - a s s a y c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n h a s b e e n c a l c u l a t e d t o b e 8 % . s a m p l e i l - 2 c o e f f i c i e n t o f c o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) v a r i a t i o n ( % ) 1 2 5 7 7 . 5 2 1 4 9 1 1 . 4 3 3 5 5 8 . 3 4 1 3 2 7 . 6 5 2 1 3 7 . 5 6 7 8 9 . 9 7 2 5 9 5 . 3 8 1 7 7 6 . 6
2 7 b m s 2 2 1 i l - 2 c . s p i k e r e c o v e r y t h e s p i k e r e c o v e r y w a s e v a l u a t e d b y s p i k i n g t h r e e l e v e l s o f i l - 2 i n t o p o o l e d n o r m a l h u m a n s e r u m a n d c i t r a t e p l a s m a , r e s p e c t i v e l y . r e c o v e r i e s w e r e d e t e r m i n e d i n t w o i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w i t h 4 r e p l i c a t e s e a c h . o b s e r v e d v a l u e s r a n g e d f r o m 7 1 t o 9 3 % w i t h a n o v e r a l l m e a n r e c o v e r y o f 7 8 % . e x p e r i m e n t 1 i l - 2 s p i k e d i n p o o l e d s e r u m a t : 1 0 0 0 p g / m l 3 0 0 p g / m l 1 0 0 p g / m l r e c o v e r y ( % ) 9 3 8 3 7 2 e x p e r i m e n t 2 i l - 2 s p i k e d i n c i t r a t e p l a s m a a t : 1 0 0 0 p g / m l 3 0 0 p g / m l 1 0 0 p g / m l r e c o v e r y ( % ) 8 1 7 3 7 1
2 8 b m s 2 2 1 i l - 2 d . d i l u t i o n p a r a l l e l i s m s e r u m ( 1 ) , c i t r a t e p l a s m a ( 2 ) a n d t w o c e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t s ( 3 , 4 ) s p i k e d w i t h d i f f e r e n t l e v e l s o f i l - 2 w e r e a s s a y e d a t f o u r s e r i a l t w o - f o l d d i l u t i o n s w i t h 4 r e p l i c a t e s e a c h . i n t h e t a b l e b e l o w t h e p e r c e n t r e c o v e r y o f e x p e c t e d v a l u e s i s l i s t e d . r e c o v e r i e s r a n g e d f r o m 1 0 0 % t o 1 1 5 % w i t h a n o v e r a l l m e a n r e c o v e r y o f 1 0 7 % . i l - 2 c o n c e n t r a t i o n ( p g / m l ) s a m p l e d i l u t i o n e x p e c t e d o b s e r v e d % r e c o v e r y v a l u e v a l u e o f e x p . v a l u e 1 - - - - 6 5 4 - - 1 : 2 3 2 7 3 5 8 1 1 0 1 : 4 1 7 9 1 8 0 1 0 1 1 : 8 9 0 1 0 0 1 1 2 2 - - - - 5 2 0 - - 1 : 2 2 6 0 2 6 0 1 0 0 1 : 4 1 3 0 1 3 5 1 0 4 1 : 8 6 7 7 1 1 0 6 3 1 : 1 0 - - 9 3 6 0 - - 1 : 2 0 4 6 8 0 4 9 9 3 1 0 7 1 : 4 0 2 3 4 0 2 5 2 7 1 0 8 1 : 8 0 1 1 7 0 1 3 2 6 1 1 3 4 1 : 1 0 - - 6 0 6 8 - - 1 : 2 0 3 0 3 4 3 2 3 8 1 0 7 1 : 4 0 1 5 1 7 1 7 4 5 1 1 5 1 : 8 0 7 5 9 8 0 5 1 0 6
2 9 b m s 2 2 1 i l - 2 e . s a m p l e s t a b i l i t y a . f r e e z e - t h a w s t a b i l i t y a l i q u o t s o f s e r u m a n d c e l l c u l t u r e s a m p l e s ( u n s p i k e d o r s p i k e d ) w e r e s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 c a n d t h a w e d u p t o 5 t i m e s , a n d i l - 2 l e v e l s d e t e r m i n e d . t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t l o s s o f i l - 2 b y f r e e z i n g a n d t h a w i n g u p t o 3 c y c l e s o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g . f u r t h e r f r e e z e - t h a w c y c l e s g a v e r i s e t o a b o u t 2 0 % l o s s o f i l - 2 i m m u n o r e a c t i v i t y . b . s t o r a g e s t a b i l i t y a l i q u o t s o f a s e r u m a n d c e l l c u l t u r e s a m p l e s ( s p i k e d o r u n s p i k e d ) w e r e s t o r e d a t - 2 0 c , 2 - 8 c , r o o m t e m p e r a t u r e ( r t ) a n d a t 3 7 c , a n d t h e i l - 2 l e v e l d e t e r m i n e d a f t e r 2 4 h . t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t l o s s o f i l - 2 i m m u n o r e a c t i v i t y d u r i n g s t o r a g e a t - 2 0 c , 4 c a n d r o o m t e m p e r a t u r e . s t o r a g e a t 3 7 c g a v e r i s e t o a b o u t 2 0 % l o s s o f i l - 2 i m m u n o r e a c t i v i t y . . f . c o m p a r i s o n o f s e r u m a n d p l a s m a f r o m s e v e r a l i n d i v i d u a l s , s e r u m a s w e l l a s e d t a a n d c i t r a t e , a n d h e p a r i n p l a s m a o b t a i n e d a t t h e s a m e t i m e p o i n t w e r e e v a l u a t e d . i l - 2 c o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a n d t h e r e f o r e a l l t h e s e b o d y f l u i d s a r e s u i t a b l e f o r t h e a s s a y . i t i s n e v e r t h e l e s s h i g h l y r e c o m m e n d e d t o a s s u r e t h e u n i f o r m i t y o f b l o o d p r e p a r a t i o n s . g . s p e c i f i c i t y t h e i n t e r f e r e n c e o f c i r c u l a t i n g f a c t o r s o f t h e i m m u n e s y s t e m s w a s e v a l u a t e d b y s p i k i n g t h e s e p r o t e i n s a t p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t c o n c e n t r a t i o n s i n t o a i l - 2 p o s i t i v e s e r u m . t h e r e w a s n o d e t e c t a b l e c r o s s r e a c t i v i t y . h . e x p e c t e d s e r u m v a l u e s t h e r e a r e n o d e t e c t a b l e i l - 2 l e v e l s f o u n d i n h e a l t h y b l o o d d o n o r s . e l e v a t e d i l - 2 l e v e l s d e p e n d o n t h e t y p e o f i m m u n o l o g i c a l d i s o r d e r a n d t h e s e v e r i t y o f d i s e a s e .
3 0 b m s 2 2 1 i l - 2 1 4 . b i b l i o g r a p h y 1 ) c o r n a b y e t a l . ( 1 9 8 8 ) . t r a n s p l . p r o c . 2 0 ( s u p p l . 1 ) , 1 0 8 . 2 ) f r o h e r e t a l . ( 1 9 8 8 ) . n e w e n g . j . m e d . 3 1 8 , 1 2 0 6 . 3 ) g r e s s l e r e t a l . ( 1 9 8 8 ) . b l o o d 7 2 , 1 0 4 8 . 4 ) h e n n e y e t a l . ( 1 9 8 1 ) . n a t u r e 2 9 1 , 3 3 5 . 5 ) h o l b r o o k e t a l . ( 1 9 8 4 ) . p r o c . n a t l . a c a d . s c i . 8 1 , 1 6 3 4 . 6 ) k i r k m a n e t a l . ( 1 9 8 5 ) . j . e x p . m e d . 1 6 2 , 3 5 8 . 7 ) m u r a k a w a e t a l . ( 1 9 8 5 ) . j . i m m u n o l . 1 3 4 , 1 8 7 . 8 ) n a l d i n i e t a l . ( 1 9 8 7 ) . j . i m m u n o l . 1 3 9 , 1 8 8 0 . 9 ) p h a d k e e t a l . ( 1 9 8 6 ) . j . i m m u n o l . 1 3 6 , 4 0 8 5 . 1 0 ) r e e m e t a l . ( 1 9 8 4 ) . s c i e n c e 2 2 5 , 4 2 9 . 1 1 ) s e i g e l e t a l . ( 1 9 8 4 ) . s c i e n c e 2 2 3 , 1 7 5 . 1 2 ) s m i t h . ( 1 9 8 8 ) . s c i e n c e 2 4 0 , 1 1 6 9 . 1 3 ) s m i t h . ( 1 9 9 3 ) . b l o o d 8 1 , 1 4 1 4 . 1 4 ) s w a i n e t a l . ( 1 9 9 1 ) . c u r r e n t o p i n i o n i m m u n o l . 3 , 3 0 4 . 1 5 ) s y k o r a e t a l . ( 1 9 8 4 ) . c a n c e r i n v e s t . 2 , 2 6 1 . 1 6 ) t a n i g u c h i e t a l . ( 1 9 8 3 ) . n a t u r e 3 0 2 , 3 0 5 . 1 7 ) t i g g e s e t a l . ( 1 9 8 9 ) . s c i e n c e 2 4 3 , 7 8 1 . 1 8 ) w i l l i a m s e t a l . ( 1 9 9 1 ) . h e m a t o l . p a t h o l . 5 , 4 5 . f o r l i t e r a t u r e u p d a t e r e f e r t o w w w . b e n d e r m e d s y s t e m s . c o m / 4 4 . h t m l
3 1 b m s 2 2 1 i l - 2 1 5 . o r d e r i n g i n f o r m a t i o n f o r o r d e r s p l e a s e c o n t a c t : e u r o p e - h e a d q u a r t e r s b e n d e r m e d s y s t e m s g m b h c a m p u s v i e n n a b i o c e n t e r 2 a - 1 0 3 0 v i e n n a , a u s t r i a , e u r o p e p h o n e : + 4 3 1 7 9 6 4 0 4 0 e x t . 1 1 4 f a x : + 4 3 1 7 9 6 4 0 4 0 e x t . 4 0 0 e - m a i l : o r d e r @ b e n d e r m e d s y s t e m s . c o m u s a b e n d e r m e d s y s t e m s , i n c . 8 4 9 h i n c k l e y r o a d b u r l i n g a m e , c a 9 4 0 1 0 , u s a t o l l - f r e e p h o n e : + 1 ( 8 6 6 ) 9 5 2 2 1 1 2 t o l l - f r e e f a x : + 1 ( 8 7 7 ) 9 5 2 2 1 1 2 p h o n e : + 1 ( 6 5 0 ) 9 5 2 2 1 1 2 f a x : + 1 ( 6 5 0 ) 9 5 2 2 2 5 2 f o r t e c h n i c a l i n f o r m a t i o n p l e a s e c o n t a c t : e - m a i l : t e c h s e r v @ b e n d e r m e d s y s t e m s . c o m w w w . b e n d e r m e d s y s t e m s . c o m c a t . n o . b m s 2 2 1 i l - 2 e l i s a
3 2 b m s 2 2 1 i l - 2 1 6 . r e a g e n t p r e p a r a t i o n s u m m a r y a . w a s h b u f f e r a d d w a s h b u f f e r c o n c e n t r a t e 2 0 x ( 5 0 m l ) t o 9 5 0 m l d i s t i l l e d w a t e r b . b i o t i n - c o n j u g a t e m a k e a 1 : 1 0 0 d i l u t i o n a c c o r d i n g t o t h e t a b l e . n u m b e r o f s t r i p s b i o t i n - c o n j u g a t e ( m l ) s a m p l e d i l u e n t ( m l ) 1 - 6 0 . 0 3 2 . 9 7 1 - 1 2 0 . 0 6 5 . 9 4 c . s t a n d a r d a d d t h e v o l u m e o f d i s t i l l e d w a t e r a s s t a t e d o n t h e l a b e l o f t h e v i a l o f l y o p h i l i z e d i l - 2 s t a n d a r d a s n e e d e d . d . s t r e p t a v i d i n - h r p n u m b e r o f s t r i p s s t r e p t a v i d i n - h r p ( m l ) s a m p l e d i l u e n t ( m l ) 1 - 6 0 . 0 6 6 . 0 1 - 1 2 0 . 1 2 1 2 . 0 e . t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n n u m b e r o f s t r i p s s u b s t r a t e s o l o u t i o n i ( m l ) s u b s t r a t e s o l u t i o n i i ( m l ) 1 - 6 3 . 0 3 . 0 1 - 1 2 6 . 0 6 . 0
3 3 b m s 2 2 1 i l - 2 1 7 . t e s t p r o t o c o l s u m m a r y - w a s h m i c r o w e l l s t r i p s t w i c e w i t h w a s h b u f f e r - a d d 1 0 0 l s a m p l e d i l u e n t , i n d u p l i c a t e , t o a l l s t a n d a r d w e l l s - p i p e t t e 1 0 0 l d i l u t e d i l - 2 s t a n d a r d i n t o t h e f i r s t w e l l s a n d c r e a t e s t a n d a r d d i l u t i o n s r a n g i n g f r o m 1 2 0 0 t o 1 9 p g / m l b y t r a n s f e r r i n g 1 0 0 l f r o m w e l l t o w e l l . d i s c a r d 1 0 0 l f r o m t h e l a s t w e l l s . a d d 1 0 0 l s a m p l e d i l u e n t , i n d u p l i c a t e , t o t h e b l a n k w e l l s - a d d 1 0 0 l s a m p l e , i n d u p l i c a t e , t o d e s i g n a t e d w e l l s - p r e p a r e b i o t i n - c o n j u g a t e - a d d 5 0 l o f d i l u t e d b i o t i n - c o n j u g a t e t o a l l w e l l s - c o v e r m i c r o w e l l s t r i p s a n d i n c u b a t e 2 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) o n m i c r o p l a t e s h a k e r - p r e p a r e s t r e p t a v i d i n - h r p - e m p t y a n d w a s h m i c r o w e l l s t r i p s 4 t i m e s w i t h w a s h b u f f e r - a d d 1 0 0 l o f d i l u t e d s t r e p t a v i d i n - h r p t o a l l w e l l s - c o v e r m i c r o w e l l s t r i p s a n d i n c u b a t e 1 h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) o n m i c r o p l a t e s h a k e r - p r e p a r e t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n f e w m i n u t e s p r i o r t o u s e - e m p t y a n d w a s h m i c r o w e l l s t r i p s 4 t i m e s w i t h w a s h b u f f e r - a d d 1 0 0 l o f m i x e d t m b s u b s t r a t e s o l u t i o n t o a l l w e l l s i n c l u d i n g b l a n k w e l l s - i n c u b a t e t h e m i c r o w e l l s t r i p s f o r 1 0 - 2 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 8 t o 2 5 c ) o n m i c r o p l a t e s h a k e r - a d d 1 0 0 l s t o p s o l u t i o n t o a l l w e l l s i n c l u d i n g b l a n k w e l l s - b l a n k m i c r o w e l l r e a d e r a n d m e a s u r e c o l o u r i n t e n s i t y a t 4 5 0 n m n o t e : c a l c u l a t i o n o f s a m p l e s w i t h a n o . d . e x c e e d i n g 2 . 0 m a y r e s u l t i n i n c o r r e c t , l o w i l - 2 l e v e l s . s u c h s a m p l e s s h o u l d b e r e - a n a l y z e d a t h i g h e r d i l u t i o n r a t e i n o r d e r t o p r e c i s e l y q u a n t i t a t e t h e a c t u a l i l - 2 l e v e l .

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